「把生物分子看得更清楚！」結構生物學最新神器–冷凍電子顯微鏡

4 月 17 日出版的《美國化學學會期刊》，蔡道明院士此次的研究成果「蛋白質酵素 3D 立體結構圖」，獲選為當期封面，可見原子級的解析力。 圖片來源│《美國化學學會期刊》（Journal of the American Chemical Society）

冷凍電子顯微術（ Cryo-electron microscopy, cyro-EM），是今日結構生物學研究最重要的技術突破。百年來，生物學家逐漸了解蛋白質、脂、核酸與醣等生物分子對生命運作的影響與機制，但過去缺乏原子級解析度的觀測工具，大大限制了生物學家的「視野」。

近半世紀，觀測技術不斷突破，構築了結構生物學一窺生命奧秘的諸多觀測方法，像 X 射線晶體學、核磁共振光譜法，以及質譜法，各有優缺點。冷凍電子顯微術以其原子級的解析力，成為最受期待的觀測神器！

結構生物學的新「視」界：冷凍電顯技術

在過去，研究者想要看到高解析度的微觀世界，電子顯微鏡絕對是不二選擇。因為電子波長比可見光還短，使解析度可高於光學顯微鏡，甚至能看見個別原子的位置。

可惜的是，電子顯微鏡也有限度！它使用高強度的電子束照射樣本，還要讓樣本處在真空環境中，導致生物分子會嚴重變質，無法觀測。 2017 年諾貝爾化學獎冷凍電顯技術，正可突破電子顯微術的問題。

冷凍電顯技術的問世，起源於蘇格蘭學者韓德森 (Richard Henderson) 以電子束觀測蛋白質「菌紫質」 。他利用留在細胞膜內的菌紫質不易因真空環境乾掉變形，以及在液態氮的冷凍環境下樣本不易受到電子束破壞的特性，証明了冷凍電顯技術可以用來觀測生物分子，並提供足以媲美 X 射線晶體學的解析度。

瑞士學者杜波克特 (Jacques Dubochet) 進一步改善冷凍環境！他的設計是：先將液體樣本鋪在金屬網格上，形成如泡沫一般的薄膜，再將薄膜浸入攝氏負 190 度的液態乙烷。這時樣本中的水會變成「玻化水」 ，意思是水凝固時不會產生冰晶干擾觀測，而是形成無結晶的玻璃化狀態。如此一來，就算將樣本放在真空的環境，也不會影響到樣本的結構。

第一步：將樣品放在金屬網上，並移除過多的樣品，樣品會在網目上形成薄膜。 資料來源│諾貝爾獎官網 2017 化學獎冷凍電子顯微鏡簡介 圖說設計│廖英凱、林洵安攝影│林洵安

第二步：將金屬網快速射入攝氏 -190 度的液態乙烷，樣本將被急速冷凍的「玻化水」包覆。 資料來源│諾貝爾獎官網 2017 化學獎冷凍電子顯微鏡簡介 圖說設計│廖英凱、林洵安 攝影│林洵安

第三步：在攝氏 -190 度的低溫中，研究員進行電子顯微鏡的觀測，可保生物分子結構不受影響。 資料來源│諾貝爾獎官網 2017 化學獎冷凍電子顯微鏡簡介 圖說設計│廖英凱、林洵安

把樣本薄膜化，再急速冷凍，就彷彿按下時間暫停器， 使生物分子保持在凍結前一刻的結構。研究者可先將生物材料調整到想觀測的環境條件下，例如：給予不同的酸鹼值，不同的反應時間，再透過急速冷凍保持其結構，就能針對同一生物分子，觀察它在不同生化機制進程的結構變化。

不過，生物分子製備成樣本，排列的角度是隨機的，拍攝的影像是二維，怎麼組合成三維的分子結構呢？美國學者法蘭克 (Joachim Frank) 發展出一種演算法，可將不同角度的二維影像分類與整合、自動合成出三維圖像。

第二步：電腦整理出所有角度的高解析度二維影像，計算影像的關聯性，得到高解析度的三維影像。 資料來源│諾貝爾獎官網 2017 化學獎冷凍電子顯微鏡簡介 圖說設計│黃曉君、林洵安

第一步：電子束撞擊隨機排列的生物分子，形成不同的影像。電腦把上千張相似的影像放在一起，變成一組，合成ㄧ張高解析度的二維影像。 資料來源│諾貝爾獎官網 2017 化學獎冷凍電子顯微鏡簡介 圖說設計│黃曉君、林洵安

關關難過關關過！科學家就這樣逐一克服冷凍電顯技術的難題。隨著技術與零組件的持續精進，冷凍電顯技術成為今日研究生物分子最具潛力的新興技術。2017 年諾貝爾化學獎，即由韓德森、杜波克特和法蘭克三人共享。

結構生物學的四大神器

除了冷凍電顯技術，結構生物學的研究也運用到 X 射線晶體學、核磁共振光譜法，以及質譜法。三項技術的原理、適用範圍有所不同，既能互相補足，也各有限制，研究者必須綜合不同技術的數據，才能推敲資料背後的自然法則。

結構生物學發展初期，研究蛋白質等生物分子的主力是 X 射線晶體學（X-ray crystallography, XRC），只能觀測結晶後的生物分子。

1950 年代起，X 射線晶體學問世！科學家利用 X 射線照射結晶後的生物分子，由於生物分子的結晶會使 X 射線繞射，只要觀測繞射後的 X 射線紋路，就可經由數學方法計算出晶體的結構。

然而 ，X 射線晶體技術觀察的生物分子，本身必須能形成分子排列整齊的晶體，但不是所有蛋白質都能形成晶體。即使可以，很多蛋白質分子必須在特定的酸鹼和溫度等環境條件下才會結晶。研究者想要觀察生物分子在不同環境下的結構變化，往往缺乏分子晶體而無法如願。

核磁共振光譜法（Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR），可研究液體樣本，但較適用小分子。

核磁共振光譜法，是將樣本放置在磁場中，利用樣本中有些原子核 (如 1H 和 13C 等)可與磁場共振，先吸收強磁場，再放出電磁波。因為分子不同，可共振的原子核數量、位置都不一樣，因此釋放出的不同電磁波訊號。研究者可從接收的電磁波訊號，反推這些原子核在分子內的數量與分布。

1980年代起，核磁共振光譜法廣泛運用在觀察溶液中比較小的生物分子，例如：比較小的蛋白分子、RNA 結構或是構築生物膜的脂質分子。但就像一把雙面刃，核磁共振光譜法難以觀測較大、較複雜的生物分子。

質譜法（mass spectrometry, MS），透過量測帶電粒子質量／電荷（m/z）比值的方式，了解物質的組成，無法「看見」物質的立體結構。

早在 1913 年，科學家就已提出質譜法。近二十年來，開始運用質譜法分析生物分子，例如正常細胞與癌細胞的差異，作為判斷癌症等疾病的輔助分析。但質譜法只能告訴我們物質的種類與數量，無法幫助我們解析物質的三維樣貌。

總括而論，既有三項技術雖揭開大量生物分子結構的奧秘，但都有限制與改善的空間。而冷凍電顯的問世，正克服了過去技術的限制，而開拓了結構生物學研究的視野。可惜的是，在生物技術研究的國際浪潮中，過去我國相關技術的建置速度，仍略遜國際科研大國。

2000 年起，因為「基因體醫學國家型科技計畫」支持，以及後續計畫經費的持續挹注，中研院陸續購入 X 射線晶體學、核磁共振光譜法，以及質譜法等儀器。2018 年 9 月，蔡明道團隊建置完成了國內首創的冷凍電顯中心。

中研院的一台高階冷凍電子顯微鏡：Titan Krios。為了不干擾冷凍電顯的觀測，整個環境設計為防震、吸音、控溫、控濕，一絲絲微風也沒有。圖中立者為中研院生化所副研究員何孟樵, 坐者為冷凍電顯中心經理張淵智。 攝影│林洵安

至此，中研院結構生物研究的四大神器已然完整到位，取得與頂尖國際研究團隊競爭的門票！

冷凍電顯中心研究什麼？

「冷凍電顯技術可以克服其他儀器的限制，在可預期的未來，勢必慢慢成為主流研究方式。」蔡明道院士堅定地說。

2019 年 4 月，在冷凍電顯中心設立短短半年後，長期投入酵素研究的蔡明道院士與中央大學生科系陳青諭老師，利用冷凍電子顯微術，觀察 KARI 酵素在原子尺度的結構，並在不破壞酵素且提高實驗效率的情況下，研究 KARI 酵素的活性如何受到酸鹼環境的影響。

這是國際上第一篇利用高解析度冷凍電顯結構來探討酶學的論文，引發關注。

這是因為 KARI 酵素與生質燃料的生產有密切關係，這項研究不只有助於理解生物機制的奧秘，還可能進入工業運用，實際解決當代能源危機與減碳難題。

除了理解生物分子結構，蔡明道院士認為冷凍電顯更重要的研究方向是：將過去生物學家對生物分子功能的理解，結合化學家對原分子尺度化學反應的理解，讓科學家更了解生化反應的機制。

除了長期投入的酵素研究以外，冷凍電顯中心可配合中研院專精的醣科學研究，以原子級的高解析度觀測蛋白質上的醣結構。或是對於疾病管制影響甚鉅的病毒研究，過去傳統上判定病毒或判斷生物是否感染病毒，常常利用血液中該病毒抗體的數量來間接推測。目前，蔡明道院士也與成大醫學中心的團隊合作，研究傳染病毒的微結構，協助疫苗研發。

臺灣蛋白質計畫的野望

在 2017 年諾貝爾化學獎的加持下，今天冷凍電顯技術已是學術界人人追求的神器。

早在諾貝爾化學獎公布之前，2016 年下半年，蔡明道院士已經洞見時代的浪潮，規劃中研院冷凍電顯中心的建置。在中研院的支持下，很快地，在 2017 年 3 月訂購了儀器，經過一年半的建置與人才培訓，在 2018 年 9 月完成建置。

冷凍電顯中心的建置，不只是取得與國際競爭的門票，蔡明道院士也戮力於優秀人才發掘與培養。

以冷凍電顯技術的 PI 和儀器經理來說，因為相關人才稀少又熱門，難以招募到已有相關經驗的外籍學者。蔡明道院士帶著國內結構生物學的研究人員，透過自學與參與國外課程、研究計畫等方式，訓練自己的技術人才。如今，中心已建置四台不同級別的冷凍電子顯微鏡，可供應初階使用者訓練、初階研究，自動化中高階研究與自動化高階研究。

此外，冷凍電顯技術的建置與人力成本高昂，最高階使用費用更需每日一萬四千元，年輕研究者的計畫經費往往難以支付。因此，蔡明道院士所主持的「臺灣蛋白質計畫」，主動尋覓相關領域的優秀年輕研究者，不只是提供經費與儀器資源，更參與研究方向與科學探索的知識辯證，達到研究與知識的合作與傳承。

近期，臺灣蛋白質計畫也著手於產學合作的發展。蔡明道院士認為蛋白質研究本身複雜度且難度夠高，研究內容也夠新穎，所需的儀器與知識，業界難以自行承擔。所以應由業界提出難度極高的問題，交由學術界研發解答，以充分發揮學術界的優勢與特性。

蔡明道院士打造的冷凍電顯中心，不僅是在儀器使用上能做到便利研究者的一體化服務，而是將厚植國家科研能力、協助產業發展、培養年輕研究人才等等崇高理想，耦合而成的知識傳承典範。

中研院生物化學研究所特聘研究員蔡明道院士，創立中研院冷凍電顯中心，以厚植國家科研能力、協助產業發展、培養年輕研究人才。 攝影│廖英凱

本文轉載自《研之有物》，一個串聯您與中央研究院的科普橋梁。