「看見」大腦記憶的生成──超解析 3D 層光定位顯微鏡

中研院院士、國立清華大學腦科學研究中心江安世，以及中研院應用科學研究中心助研究員陳壁彰，合作研發出可透視果蠅全腦的超解析 3D 層光定位顯微鏡，並利用化學方法把果蠅大腦變「透明」、可見光能通過，終於得以窺見果蠅腦部深處被螢光標定的單分子神經，藉此建構果蠅全腦神經網路地圖。去年團隊藉著這項技術，「看見」記憶蛋白在大腦深處特定神經細胞突觸上的新生，初步揭開大腦記憶的神秘面紗。

精彩故事，是這麼開始的……

解析度、廣度，統統都要！

先來說說傳統顯微鏡的問題！傳統光學顯微術能夠解析的最小距離，大約 250 奈米左右。也就是說，如果兩個發光分子之間的距離小於這個極限，因為光波的繞射特性會使分子影像變得模糊。這個鑑別距離極限，定義了光學成像的「解析度」。

"傳統光學顯微術的「繞射極限」，硬生生地限制了科學家一窺腦部全貌的夢想。"

大腦神經突觸的大小約在 20 到 40 奈米之間，與腦部分子活動相關的神經結構尺度也在數十奈米。可想而知，運用傳統「粗線條」的光學顯微術觀察大腦，一定會有「見林不見樹」的問題：即使可知大致的神經走向，也無法得知細微變化。但魔鬼，就是藏在細節裡啊~~

另一方面，傳統顯微鏡還有視野廣度或視野大小的問題。神經突觸的大小是果蠅大腦 (約數百微米) 的數千分之一。想要解析特定分子在大腦的分布，困難度就像用小小無人機空拍一個籃球場，還要定位籃球場上每隻螞蟻的正確位置。

但在顯微鏡的世界裡，解析度和視野廣度本是兩個極端，想要一種技術、兩種滿足，必須找到非比尋常的解決之道。

關關難過關關過

首先，這種顯微技術必須能夠定位腦神經細胞中個別分子。衡量各種超解析顯微術的優勢與適用範圍，「單分子定位顯微術」（single molecule localization microscopy) 具有數十奈米等級的空間解析度，得以鑑別相距約 20 奈米的分子，恰好符合神經生物學家對解析度的要求，無疑是首選工具。

圖片來源│ 呂杰翰 圖說美化│林洵安

再者，因為神經網路遍佈全腦，並非僅侷限在大腦的表層，此顯微術必須能看得又深又清楚，才能重建果蠅大腦完整的三維影像，提供全面而精密的分子地圖。近年熱議的「層光顯微術」(light-sheet microscopy) 可快速取得大範圍樣品的影像，成為不二首選 。

再加上，江安世院士團隊透過生物組織澄清技術，運用化學方法讓果蠅腦變透明、能讓可見光通過，然後以層光掃描透明大腦，輔以上述單分子定位顯微術，即可在短時間內偵測大腦內的個別分子位置，稱為「透化層光定位顯微鏡」。

中研院應用科學研究中心陳壁彰助研究員與透化層光定位顯微鏡。 圖片來源│中研院秘書處

跨領域合作，打開大腦的潘朵拉盒子

有了既定的策略，抽象的概念立刻轉化為一個跨界、甚至跨國的技術整合問題。

陳壁彰助研究員與江安世院士合作，將一個由國家實驗研究院儀器科技中心打造的特殊顯微物鏡，整合入實驗室既有的掃描式貝色層光顯微鏡 (Scanning Bessel beam light-sheet microscope)，建構出針對透明化樣品最佳化的超解析顯微鏡，並應用日本東京大學 Yasuteru Urano 團隊開發的新型閃爍螢光染劑 HMSiR 標定腦內分子，讓每一個參與大腦記憶生成的分子，發出清晰且明亮的光訊號。論文第一作者、現任國立清華大學生醫工程與環境科學系助理教授朱麗安興奮地說：

"身為一個生物學家，使用自己建造的顯微鏡系統，就像打開潘朵拉的盒子，突然什麼都變成可能！"

因為商用顯微鏡大多有鏡頭選用、解析度等限制，尤其層光顯微鏡在鏡頭選擇上更是有諸多限制。

那麼，這項新的顯微鏡系統，會對神經科學帶來什麼改革呢？首先，神經訊號的傳遞仰賴神經突觸電位及神經傳導物質的傳遞，想要了解大腦的活動，必須解析突觸上的細微變化，如蛋白質的生成。以模式生物果蠅為例，神經突觸只有幾百奈米，過去只能仰賴電子顯微鏡。但電子顯微鏡的樣品製備非常繁複，並需要將組織切片，無法呈現完整的神經結構，一次能看的樣品範圍也很小。

電子顯微鏡的另一個問題是「很花時間」。美國珍利亞農場研究園區 (Janelia Research Campus) 所做的全果蠅腦電子顯微鏡連續切片影像，單一個果蠅腦就需花費 16 個月拍攝完成，再經過無數的工程師進行影像處理，不利於統計分析。

透化層光定位顯微鏡，可在比細胞大將近一萬倍的組織 (如果蠅大腦)，定位其中所有蛋白質分子，進行果蠅全腦的攝影。而且全腦攝影可在一天之內完成，期間僅需移動樣品四次，大幅降低機械移動造成的誤差與後續影像處理的複雜性。與傳統的顯微技術比較，新技術能在合理的時間內拍攝大量樣品，即時提供生物學家更大的統計樣本。去 (2019) 年初已初步告捷！新的顯微技術一次解構果蠅全腦的多巴胺神經網路，「看見」記憶蛋白在特定神經細胞突觸上的新生，可望揭開大腦記憶機制的神秘面紗。

果蠅全腦多巴胺神經多尺度圖像(上)，細部的神經結構(左下)，以及放大展現出非常複雜、但可經由新顯微術辨識的神經網路(右下)。 圖片來源│陳壁彰

看見記憶、解密大腦疾病

昆蟲腦部的蕈狀體分布了一種囊泡單胺運轉蛋白質（vesicular monoamine transporter），與昆蟲的嗅覺與記憶功能息息相關，是一種在腦部負責訊息傳遞的重要分子。只要標定這種蛋白質分子的精確位置，即可從中歸納出與記憶有關的分子機制。

本次研究發現：在讓果蠅進行特定的記憶訓練後，只有特定的神經突觸會增加囊泡單胺運轉蛋白質表現，顯示這些神經在記憶過程可能肩負重大功能。 藉由類似的實驗，神經科學家可以釐清神經變化和特定腦部活動的關聯，進一步理解神經在腦部記憶生成的機制，以及神經可塑性 (placiticity) 的變化，破解大腦記憶之謎。

左圖是超解析之果蠅眼部單一神經，右圖是超解析全腦囊泡單胺運轉蛋白在神經上的分佈。 圖片來源│Rapid single-wavelength lightsheet localization microscopy for clarified tissue

另一方面，由於鼠腦被普遍使用於與人類腦部疾病有關的研究，未來江安世院士研究團隊也計畫以此探索老鼠腦，揭密與蛋白質分布有關的機制，對於解答部分人類腦部疾病做出貢獻！

「目前為止，我們已經觀察果蠅在訓練前後的神經活動，並且能夠分辨尺度在數十奈米左右的變化，這對釐清分子在神經可塑性中扮演的角色提供很大的幫助。」朱麗安期許未來：「十年後的目標是將影像解析度提升到 10 奈米，並試著應用於活體，即時觀察神經在腦部活動下的重塑，終極目標是理解學習行為的詳細機制！」

也許不遠的未來，新的顯微技術可以觀察生物學習當下發生的每一個細微腦部變化，解密人之所以為人，是如何從經驗學習成長。

本文轉載自《研之有物》，一個串聯您與中央研究院的科普橋梁。